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La scoperta della penicillina è attribuita al medico e biologo Alexander Fleming. Nel 1928, Fleming condusse delle ricerche su alcuni batteri patogeni, coltivandoli in apposite piastre di coltura. Una di queste piastre fu contaminata da un fungo, il Penicillina notatum (oggi conosciuto come Penicillium chrysogenum). La cosa che colpì di più Fleming, non fu tanto il fatto che il fungo fosse cresciuto nel mezzo di coltura, ma il fatto che fosse in grado di uccidere tutti i batteri che gli stavano intorno, creando un alone d’inibizione di crescita batterica attorno alle proprie colonie. Fleming, capì subito che l’attività antimicrobica poteva essere attribuita a una sostanza prodotta da quello stesso fungo. Dopo svariati tentativi, Fleming riuscì finalmente a isolare da quel fungo una sostanza dal potente effetto battericida che chiamò penicillina. Fleming somministrò la sua penicillina ad animali infettati con i batteri che in vitro risultavano sensibili a questa sostanza e riuscì ad ottenere risultati positivi. Il successo ottenuto negli animali, spinse Fleming a tentare la somministrazione della penicillina anche a pazienti che avevano contratto infezioni. La provò per la prima volta su un paziente terminale affetto da setticemia. Si trattava di un poliziotto londinese di nome Albert Alexander, cui fu somministrata per via endovenosa una quantità di antibiotico pari a 160 mg. Ventiquattrore dopo la sua temperatura iniziò a scendere di pari passo con il ridursi dell’infezione. Purtroppo per lui la quantità di penicillina non era sufficiente e ciò, un mese più tardi, lo condusse alla morte. La penicillina ottenuta dalle colture di P. notatum, in realtà, non era una singola molecola, bensì una miscela di diversi composti che si differenziavano per alcune variazioni della loro struttura chimica. Si scoprì in seguito che apportando delle modifiche alla composizione del mezzo di coltura si potevano ottenere molecole diverse. Più precisamente, si scoprì che aggiungendo al terreno di coltura acido fenilacetico, si otteneva soprattutto la penicillina G (oggi conosciuta come benzilpenicillina). Se nel terreno di coltura, invece, erano presenti grandi quantità di acido fenossiacetico, si otteneva soprattutto la penicillina V (oggi conosciuta come fenossimetilpenicillina)
